科研 | EMBO J . ：有关HIV-1感染的宿主细胞胞外囊泡组成和动力学的非偏性蛋白质组学研究

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编译：微科盟向阳而生，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

释放各种类型细胞外囊泡（EV）的细胞，可将复杂的信号转导至周围细胞中，但用于鉴别不同EVs的特定（例如：外泌体，细胞和外粒体，HIV样的包装病毒）标记仍然缺乏。我们开发了一种蛋白质组学方法用于鉴别EV亚型的组成并将其应用于人类JuratT细胞。我们建立了一个交互的数据库对具有相似特征的蛋白组进行定义，定义的依据是释放相似的EVs。生物化学验证证实了在EVs中通常优先使用的EVs中伴侣分子的外泌体标记物：CD81/ADAM10/ITGB1，以及CD63/细胞内衔接蛋白。我们接着比较了来自对照组和HIV-1感染的细胞中的EVs。HIV感染改变了几个细胞内蛋白的EV谱，包括MOV10和SPN，这两种蛋白可整合到HIV病毒颗粒中，同时SERINC3，可以以一种Nef依赖的方式改道进入非病毒性的EVs中。我们进一步发现SERINC3控制了EVs的表面组成。我们的工作流程提供了鉴别候选标记和EV亚型潜在调节因子的无偏方法。这可以被广泛的应用于体外试验系统，以研究EV生理或病理变化。

论文ID

原名：Unbiased proteomic profiling of host cell extracellular vesicle composition and dynamics upon HIV-1 infection译名：有关HIV-1感染的宿主细胞胞外囊泡组成和动力学的非偏性蛋白质组学研究
期刊：The EMBO Journal
IF：9.885发表时间：2021.04通讯作者：Georg H H Borner & Clotilde Théry通讯作者单位：德国马克斯普朗克生物化学研究所，巴黎文理研究大学

实验设计

实验结果

1.由HIV感染的以及对照组Jurkat细胞的生化和超结构特征
我们采用Jurkat T细胞系作为一种实验模型去研究EVs在不同生理学条件下释放的多样性。首先，我们将EVs从Jurkat细胞中分离出来，差速离心后，在低速，10000g和100000g速度下分析了EVs蛋白颗粒（2000g，2K颗粒）。正如MISEV2018指南所推荐的方法，在跨膜蛋白（CD9和CD63跨膜四超蛋白）和细胞溶质蛋白（细胞内衔接蛋白-1或活力素）存在的条件下分析了2K，10K和100K蛋白质颗粒：这证实了EVs的存在，而内质网蛋（也被称为GP96，基因HSP90B1）在外来体中不存在，而在EVs中可能存在。另外，我们分析了来自HIV的标记分布，这些标记被用于鉴别sEVs：跨膜蛋白CD45（基因PTRPC）以及分泌或GPI锚定蛋白AChE（基因ACHE）。正如图1A所示，GP96主要在2K颗粒中被发现，而CD63，活力素以及CD9主要在2K颗粒中被发现。这些小的EVs（sEVs）标记细胞内衔接蛋白-1（基因SDCBP）在100K颗粒中富集，也在Jurkat CCM的10K和2K颗粒中被发现，而CD45和AChE在2K和10K颗粒中比在100K颗粒中富集程度更高。透射电镜分析（TEM：图1B）的材料来自100K颗粒，并表现出很多小颗粒的EVs（50-150nm直径）。一些sEVs在10K和2K的颗粒中被发现，通常富集在EVs介质中（图1B，左下图）。大于200nm的EVs在10K颗粒中富集；相反，大分子质量的蛋白颗粒在2K左右大小的蛋白质中被观察到，同时我们还观察到高比例的小于50nm电子密度的纳米颗粒。该分析支持了sEVs在100K颗粒中高度富集。接着，我们通过HIV-1（NL4-3 EGFP-Nef⁺病毒）感染Jurkat细胞，在感染后，对Jurkat细胞进行充分洗涤并在缺乏EV的介质中进行培养。EVs（包括新形成的病毒）从CCM中被分离出来，其蛋白组分通过上述相同的标记进行分析，加上Gag24蛋白作为病毒的标记（图1C）。标记不同部分的蛋白的分布与未感染蛋白的分布具有一定的可比性，并且病毒p24蛋白主要在100K颗粒中存在。重要的是，在感染过程中，正如在对照组细胞中（图1A），CD45和AChE在大的/中等的EV组成中比在sEVs（100K颗粒中）更加丰富。我们进一步的通过之前所描述的碘二沙醇梯度（图1D）在含100K颗粒中分离出sEVs。我们发现至少两种不同类型的sEVs位于100K颗粒内，两者均包含一般性的EV标记物CD9。我们在最高梯度离心条件下收集到的片段包含一些CD45，但同时也包含一些CD63，而中等梯度（碎片5-8）收集到了更多的CD63，它们富集在外泌体中。另外，在感染细胞碎片的底部（碎片9-12），我们检测到富集的病毒p24蛋白质以及CD63，但未检测到CD9和CD45（图1D）。重要的是，AChE，当被检测到时，仅位于最高层的碎片中；因此，这些蛋白不仅仅在非p24的碎片中被发现，也在其它非sEVs的标记蛋白中被发现。总之，正如最近在AChE中所描述的，这些现象表明CD45⁺和AChE⁺的EVs分别代表了中等/较大的EVs，或者其他包含了sEV颗粒的颗粒状物质，而不是代表非病毒的sEVs。因此，虽然它们实际上从包含病毒的组分中被排除，但AChE和CD45都不是将HIVs从sEVs中分离出的有用标记。不仅如此，速度梯度离心的分布结果表明一些蛋白可能进入了HIV病毒蛋白颗粒或者这些蛋白释放的EVs通过感染HIV-1而发生改变。一个详细的有关sENs亚型的特征分析需要考虑这两种可能性。图1 未感染和感染 HIV 的 Jurkat 细胞产生的 EV 的表征
（A-D） EVs通过差速超速离心（A-C）从非感染的（A,B,D）或HIV-1感染的（C,D）Jurkat细胞中被分离出来，同时包含在100K颗粒中的sEVs通过碘二沙醇梯度（D）进行进一步的分离。（A，C）后续的颗粒（2K，10K，100K）CONG 20 × 10⁶个细胞中收集并通过Western blot对于指示蛋白在0.4 × 10⁶的溶解液产生的细胞中进行并行分析：（C）两个不同的代表性试验的图像。从2K，10K和100K颗粒中收集的蛋白在未经染色的胶图中进行分析，并且在各图像中相似：在对照细胞组（A）针对2K，10K和100K的AU（在2K+10K+100K中给定颗粒/总蛋白含量）分别为1.13 ± 0.28, 0.96 ± 0.10以及0.91 ± 0.33，在感染细胞中（C）（平均值 ± 标准差）（B）全部EM分析显示代表性图以及在2K，10K和100K颗粒中的蛋白质大小的分布（比例尺，200nm）。（D）从非感染和感染的Jurkat细胞的CCM中通过碘二沙醇梯度100K颗粒中获得的12个组分，并通过Western blot对相应蛋白质进行分析。 2. 无偏的定量蛋白质组学可鉴别出EV相关的蛋白簇
由于针对不同EV亚型的标记蛋白可在密度梯度离心中显示出重叠的谱学，蛋白组学分析方法对于确定EV的组成是不充分的。一个更加有力的方法是在跨越整个速度梯度的基础上根据蛋白谱的相似性去了解其分布。但是，对于12个组分的分析，跨越多个重复和生物学条件，需要大量的资源并且具有技术上的多变性；上述试验有限的可重复性存在应用方面的局限。一个更加简单的方法是设计一个短期的差速离心步骤以部分分离EV亚型以及以很高的准确性对蛋白质的分布进行定量。这种方法，最初针对分析细胞间囊泡所开发，具有高度可重复性，它能够解决从大的细胞器到蛋白质复合物的细胞间结构分析的复杂问题。这里，我们采用这种方法对介质和包含在CCM（10K和100K）中的小的EVs进行分析。重要的是，这些差速超速离心参数（速度和时间）需要被优化，使得我们在每一个离心步骤中都能收集相似量的蛋白质（附图S1A和B）。来自SILAC介质标记的Jurkat培养基中的CCM在接受3个连续增加速度（10K，30K和100K）的连续离心过程中通过2K离心排除了细胞和较重的EVs。我们收集这些蛋白质颗粒以获得CCM的亚组分F1，F2和F3。同时，通过100K离心法收集通过SILAC标记的细胞“参考”组分（附图S1C）。我们采用了三个生物学重复（A，B和C），这些亚组分在质谱分析和定量之前与其同源的参考片段混合，超过3300个蛋白质在所有3个重复中被进行定量（数据集EV1），质谱分析也在相应的释放的细胞中进行，以产生全蛋白组定量（数据集EV1）。F1-F3的蛋白质丰度谱使得定义具有相似分馏行为的蛋白质成为可能，即：存在于细胞外结构或具有相同颗粒化性质（即：大小/密度组合）的EVs。例如，一些F-活力素相关的蛋白ACTB，ACTN1和ACTN4在F2和F3亚片段中具有密切相关的特征（图2A）；相反，参与胞浆移动/中间体形成的蛋白，比如KIF23，RACGAP1和KIF14等具有极度相似的特征并且在F1组分中丰度较高。CD81表现出与ITGA4和ITGB1近乎相同的组学特征，整合素杂合二聚体（IGTA/B）复合物的一些伴侣分子在F3组分中的含量达到峰值。由于SILAC定量的高精确性，甚至非常微小的组学差异都能够被解决。因此，当CD63和CD81都在F3达到峰值，其组学在不同重复之间持续的存在差异，表明至少有一些不同的EV亚型的参与（图EV1A）。接着，我们通过主成分分析（PCA）所有蛋白质谱对数据进行可视化并通过已知的细胞器标记做了一些“细胞器地图”。这些图显示组学可分析的EVs的亚型是基于其亚细胞来源；例如，线粒体蛋白可从浆膜或内涵体蛋白中被明确的分离出来（图2B）。之后我们提出了一系列位于sEVs中的标记蛋白质，可表达CD63、CD9或者CD81四黄烷类蛋白（附表S1，图2B）。我们观察到sEVs标记位于浆膜各标记和内涵体之间，并且从内质网或线粒体内的细胞间定位蛋白中被分离出来（图2B）。另外，我们计算了在每个Jurkat CCM亚片段中检测到的细胞器标记的相对Jurkat全蛋白组的富集情况（图2C；数据集EV1）。这表明线粒体和ER蛋白质发生较强的消耗，以及浆膜蛋白质较强的富集。这些观察结果表明Jurkat CCM具有与整个Jurkat细胞截然不同的组成。而其包含了来自不同细胞间来源的组分，这些组分高度富集在浆膜来源的成分中。为了鉴别具有相似特征的蛋白质组，我们接着构建了“邻接网络预测因子”（NNP；见表EV1，对于具有基础分析功能的数据，以及针对完整的具有网络构建特征的交互数据库http://evprofiler.institucurie.org）。这个交互工具可被用于获得针对某种蛋白的一系列具有相似特征的蛋白质。通过对接近某个被质疑蛋白局部距离分布的建模，并且考虑各种生物学重复的可重现性，我们获取了各种距离分割点以定义该被质疑蛋白的“邻近对象”。不仅如此，通过对质询蛋白邻近对象成员之间的相似性进行评分，NNP组建了反映紧密共谱化蛋白簇的网络图。由于一些蛋白质在不同类型的EVs中被共享，所以不能够预测蛋白簇边界或者纯粹的群体组成。然而，NNP允许粪便具有相似特征的蛋白质，表明优先参与到相同类型的EVs或细胞外结构中。首先，我们检验了NNP鉴别稳定的蛋白复合物的能力，这些NNP据有紧密相连的特征。事实上，已知的多蛋白复合物显示出不同亚基的网络。例如，质询具有CD3复合物（CD3G）γ链的NNP显示出包括CD3D，CD3E和CD3Z的紧密网络，以及T细胞受体α和β链（TRAC，TRAV，TRBC1，TRBV12-3）（表EV1，图EV1B）；两种整合素α4（IGTA4）以及整合素αv（IGTAV）具有与其相应的最近邻居伴侣蛋白（ITGB1和ITGB3）（表EV1）。这些数据支持了我们的方法能够鉴别出功能上相关的蛋白质组。 图2 Jurkat 细胞释放的 EV 亚型的非偏性蛋白质组学分析
（A）不同蛋白质的蛋白质谱，显示出来自Jurkat细胞的3 × 3亚集的相对丰度。具有相似谱学特征（由相同颜色表示）的蛋白是相同EV亚型的可能部分。每个谱包括了三种独立的数据三联体（F1-F2-F3A，F1-F2-F3B以及F1-F2-F3C）。（B）EVs中超过3000个蛋白在10K（F1），30K（F2）以及100K（F3）离心后的谱学丰度（见附图S1），Jurkat细胞采用主成分分析（PCA）法进行分析。每个点代表一种蛋白质；邻近的点表明相似的谱以及相似的跨越EVs的分布。PCA评分图采用已知的细胞器标记蛋白进行注释，并采用人类树突状细胞中携带sEVs的针对CD9-或者CD63-或者CD81-特异的之前所鉴别出的标记（附表S1），正如图例所表示的。非标记蛋白用灰色点显示。不同的亚细胞来源的EVs通过组学分析进行分离。PC1和PC2可解释数据44.5%和19.1%的变异。（C）提琴状点为跨越F1-F2-F3亚集的细胞内蛋白质标记。实心水平线表明中位数，虚线表明四分位数（n = 3）。线粒体和ER标记是去富集化的，而浆膜标记富集在EV组分中，具有从F1到F3的显著效应。（D，E）针对单个蛋白CD63（E,**网络成员，重复数 = 3）的邻接网络图（上25%分位边界）以及CD81（D，*网络成员，重复数 = 2），显示在CD63网络中几种ESCRT组分，以及在CD81网络中的ARRDC1和整合素ITGA4/B1。一种针对这两种蛋白以及CD3G的多组分网络，在图EV1中显示，表明所有3个网络是处于分离状态的，表明标记在不同的EV亚型中存在。节点：红色 = 被质疑蛋白，橙色 = 所有3个重复中的邻近成员，灰色 = 三个重复中的两个邻近成员。边：局部距离分布的百分数；见材料与方法。 我们接着通过常用的EV或外泌体标记蛋白查询了NNP（邻接蛋白网络），以研究Jurkat细胞分泌的EVs所对应的蛋白质组。我们选择了严谨的截断点并集中于瞬时的邻近网络。CD81和CD63具有较为密集的邻近蛋白，这些蛋白是分开的（图2D和E）。CD81^-邻近蛋白包括ARRDC1，ADAM10以及ITGA4/ITGB1，表明在此种情况下CD81主要在浆膜来源的EVs中获得。相反，与CD63紧密相邻的蛋白大多数是核内体来源的，包括SCAMP1，Alix，SNARE VTI1A以及几种ESCRT蛋白，表明这些蛋白对应的形成在内泌体小室或浆膜内泌体样区域的EVs中。为了获得更加广泛的EV簇关联通路，我们采用3种方法查询了NNP：CD81，CD63以及CD3G（图EV1C）。产生的多组学图支持三种蛋白质标记了大多数的非重叠蛋白簇的结论。不仅如此，后续的工作表明CD81簇也包含了CD82，同时CD63簇包含了细胞内衔接蛋白1（SDCBP）。ESCRT1蛋白与CD63簇和TCR/CD3簇具有强相关性，表明它们之间的潜在关联性。NNP的输出并未提供EV蛋白组；相反，相邻蛋白簇表明具有相似分离行为的蛋白组，与一种或多种EV类型具有相似的分布。我们预测，例如，CD81和ADAM10在相同的EV亚型中被发现，即，任何包含CD81的EV应包含ADAM10，反之亦然。相同的情况适用于CD63和细胞内衔接蛋白1（SDCBP）。该NNP因此是一种针对相同的EV亚型对多个标记进行定义的工具。如果两种蛋白位于不同的NNP簇中，它们可能（i）对于不同的EV类型是相互排斥的标记，（ii）可能可以标记一种携带其他标记的EVs亚群或者，（iii）有三种分别发生或联合发生的类群。例如，针对CD63和CD81分别的簇表明3个中至少有2个EV亚型：CD81⁺/CD63^-，CD81^-/CD63⁺，以及CD81⁺/CD63⁺，但是NNP本身不能预测哪种存在。总之，我们的分析表明Jurkat细胞可释放多种EVs，其中特定的蛋白质与每种不同类型相关，并且强调了我们定义EV标记蛋白质方法的效力。NNP可以通过任何在Jurkat CCM中的蛋白进行查询。
3. 对在不同网络中鉴别出的EV标记的深度生化分析
接着我们采用正交生化方法证实和定义了从NNP推断出的预测结果。我们根据多网络分析集中于CD63，CD81和CD3，正如图EV1C所示，这些蛋白位于各个分离的蛋白簇中。首先，我们将EVs从大的EVs的Jurkat CCM中进行免疫分离（2K颗粒），采用靶标为CD63或CD81的包裹抗体的颗粒。我们通过Western Blot分析比较了EVs仍然位于流通小室（FT）PD EVs中（图3A）。我们分析了两种四黄烷类蛋白的存在，CD3G以及包括在CD81和CD63簇中的两种蛋白质（分别是ADAM10和同线性蛋白1）。对于PD和FT的分析采用抗CD81磁珠进行，并且对所有携带CD63的EVs，细胞内衔接蛋白1和ADAM10采用CD81抗体进行捕获，但是少量的携带CD3G的EVs在FT中可被检测出来。因此，CD81⁺EVs代表了Jurkat中EVs的主要类群，同时CD81⁺和CD81^-CD3G⁺EVs共同存在，与我们的NNP分析结果一致。在被抗CD63磁珠捕获后，该磁珠分离了多于90%的CD63和包含EVs的细胞内衔接蛋白，超过30%的ADAM10，CD81和CD3G信号仍然位于FT中。这些结果表明携带CD63的sEVs包含细胞内衔接蛋白1并代表了CD81-EVs亚群（图3A和定量），这再一次与我们的NNP网络分析结果一致。重要的是，相似的结果从CD4⁺初级T细胞（图EV2A）的EVs中被分离出来并且具有相当丰富的CD81⁺CD3G⁺和CD81^-CD3G⁺EVs。为了分析这些标记在单个EVs中的存在，我们采用了免疫EM（图3B）。因此我们证实了CD81⁺EVs和CD81⁺/CD63⁺EVs的存在并且用相似的方法观察了本身为CD81^-的CD3G⁺EVs。最终，我们通过商业化多重流式细胞分析的方式分析了EVs的表面特征，这使得检测EVs中两种蛋白的共同存在成为可能（图3C）。我们用不同单抗包裹的磁珠被用于捕获EVs，然后采用抗CD81，CD63或CD3E的共轭抗体APC进行标记。对于所有捕获磁珠，我们将抗CD81抗体捕获的APC信号与采用抗CD63或抗CD3E抗体捕获的信号进行对比，验证了CD81在Jurkat细胞中释放的EVs的富集。另外，通过包裹抗CD2和CD29的磁珠捕获的EVs对于CD81是强阳性的，证实了这两种标记物在CD81⁺EVs中的存在，正如NNP分析的结果所表明的（图EV1C）。与采用抗CD81抗体检测到的EVs相比，CD63⁺EVs代表较低的APC平均值（图3C）。但是，CD63/CD81信号对于所有标记都持续的位于0.08到0.11之间（图3D），该结果进一步支持CD63⁺EVs是CD81⁺EVs的亚群的结论。虽然针对CD3E⁺EVs可检测到的信号也低于CD81信号，但当其与CD63-EVs相比（图3C和D），一些标记显示出相对较高的信号（CD45）或较低的信号（CD81）。有趣的是，当在NNP中搜索这4种蛋白时，CD45（= PTPRC）比CD63网络更接近与CD3E，与生化法证实结果一致。来自初级CD4⁺T细胞中相同的分析（图EV2B）显示出与CD3E信号相似的结果，与CD63信号检测结果相比，比CD81⁺EVs信号低，比CD45⁺EVs信号高。总之，生化分析证实了有关NNP分析的集中预测结果并进一步修正了其解释。相似的结果在初级CD4⁺T细胞中获取，表明我们基于Jurkat NNP的工具对于这些细胞具有预测价值。 图3 对由Jurkat细胞释放的EVs的生化分析EVs通过SEC从Jurkat细胞的上清液中进行纯化。（A）  EVs采用与偶联的抗CD81或CD63的抗体进行免疫分离。磁珠相关的囊泡以及那些滞后的蛋白被置于Western Blot胶进行分析，采用针对CD63，细胞内衔接蛋白-1，ADAM10和CD3G的特异性抗体。一个代表性的条带（顶部图）和对FT中的信号比例定量与总的（PD + FT）来自4个独立试验（底部图）进行比较。（B）来自Jurkat细胞通过SEC纯化双免疫标记的EVs代表性的图像，CD81/CD63；右侧图，CD81/CD3E。箭头表明CD63在CD81⁺CD63⁺EVs中进行染色。（C）基于多重磁珠的流式细胞分析检测EV表面标记。抗体包裹的捕获磁珠与2 × 10⁹个颗粒进行共孵育。捕获的EVs与APC标记的抗CD81，抗CD63或抗CD3E进行检测。C表示对于不同的磁珠群体的中位数APC荧光值作为与APC荧光值中位数的对照磁珠（log10比例）比例。对于四个独立实验的平均值 ± 标准差。（D）热图代表了APC荧光值中位数采用采用抗CD81检测获得的值相对于抗CD63或抗CD3E抗体对于不同磁珠类群进行检测。4个独立实验的平均值。 4. sEV蛋白组成的改变通过Jurkat细胞造成的HIV-1感染
我们接着采用自己开发的方法通过HIV-1感染的过程理解从Jurkat细胞中释放的EVs。这种病理学情形包括通过病毒部分剥夺了EVs生物学合成过程中细胞的机械运作方式。两个对照和两个被NL4-3 EGFP-Nef⁺ HIV感染的Jurkat细胞的生物学重复以平行的方式被呈现（附图S1）。通过质谱分析，我们对在来自对照组和HIV-1感染样本多于3000个蛋白进行组学分析，其中2805个蛋白在四组中都是共同存在的（图4A，数据集EV2）。在来自感染细胞的CCM中，HIV-1蛋白在最后的片段中（F3）显示出丰度很高很紧密的配对组学特征，但是这些蛋白与宿主EV蛋白CD81，ITGA4和ITGB1可清楚的进行鉴别（图4B）。所有蛋白质的丰度图谱显示出大多数来自HIV-1的蛋白簇在相同的象限中大多为sEV蛋白（附图S2A）。我们首先问了一个问题，即是否任何邻近宿主的蛋白也是邻近HIV蛋白簇的。我们构建了邻近预测因子工具（表EV2），采用对HIV p24进行查询的数据，我们追踪了所有可检测到的HIV-1蛋白，除了Nef是可被首先比对上的，后续是宿主蛋白SPN和MOV10（表1），表明这些细胞组分被包含在病毒粒子中。通过查询所有的HIV-1蛋白质可在前几个比对上的蛋白中鉴别出SSPN和MOV10，除了HIV-Nef，其邻近的蛋白包括TSG101，CD63以及VPS37b，但是没有发现其它病毒蛋白。这些观察结果表明被HIV感染的细胞可释放完整的病毒，但是其它内源性EVs也包含了病毒的Nef蛋白。我们接着比较了感染和未感染的状况以鉴别宿主中在感染的亚组分间改变分布的蛋白质，并且检测了其在PCA图谱中的位置。我们通过异常值检测对在不同生物学重复的蛋白谱中蛋白的运动（M）以及可复制性（R）进行检测，并因此鉴别出26种经历了显著运动过程的候选蛋白质（高严格程度筛选，FDR = 8%）（表2，图4C，数据集EV2[包括比对上的蛋白的扩展名单，中等严格程度，FDR= 20%]）。与MR分析结果一致，MOV10的图谱（最前比对上的蛋白，M = 10.55）通过增加F3组分的丰度改变HIV-1感染，例如，CD55图谱（M = 0.01）在对照和HIV-1感染的情况下不会发生变化（附图S2B）。26个候选蛋白组分的变化表明了其与不同EV亚型相关，或者与其大小，性状和/或EVs本身的密度的变化（虽然在多种蛋白的情况下应经历相同的变化）相关。我们在HIV感染后的PCA图谱中通过比较每种候选蛋白同时评估了谱学的变化（图4D；见表2的详细分析）。鉴别出的两种蛋白被预测为HIV蛋白的近邻（MOV10，SPN），并向HIV蛋白簇方向运动；相反，SERINC3（之前研究中CD63网络中的一个成员：图2E和EV1C）向HIV簇相反的方向运动。通过邻近分析，SERINC3从未被发现接近HIV-1蛋白，表明该蛋白主要包含在非病毒颗粒的EVs中。基于此结果，我们对SERINC3，一种远离HIV簇的非病毒EVs的运载蛋白进行了更加详尽的分析，同时认为MOV10和SPN是向HIV蛋白运动和最近的相邻预测因子的病毒颗粒的候选蛋白。
5. SERINC3被发现位于宿主EVs中，而MOV10和SPN则包含在病毒颗粒中
为了证实候选蛋白是特定的宿主sEVs或病毒颗粒组分，我们首先通过差速离心的方法富集了来自条件介质中对照组和感染细胞病毒颗粒以及EVs。通过经典的顺序离心方法（2K，10K，100K），我们对SPN，MOV10，SERINC3以及病毒标记p24在不同颗粒中的存在通过商业化抗体进行评估。正如图5A所示，我们主要在来自Jurkat感染细胞的100K颗粒与p24颗粒一起检测了SPN和MOV10。SERINC3不仅在Jurkat感染细胞的100K颗粒中被检测到，而且在来自对照和感染CCM的颗粒中也被检测到。对于每种与总蛋白含量相关的蛋白信号的定量分析表明SERINC3特异性的富集在来自5个独立试验的对照或感染CCM颗粒中（图5B）。相反，SPN和MOV10则富集在感染的CCM的100K颗粒中，与病毒p24的感染方式相似。图4 鉴别分泌受到HIV病毒感染改变的候选蛋白
（A）通过在对照组和HIV感染的细胞的EVs的6个片段中进行质谱分析所鉴别出的蛋白质数量。大多数蛋白在两个样本中被定量。（B）不同蛋白的蛋白质谱（如图2所示），显示出6个片段的相对丰度。每个蛋白质谱包括两个独立的数据三联体（F1-F2-F3A和F1-F2-F3B）。相同组蛋白的丰度谱如图2所示显示出相同的蛋白簇行为，但是在该第二个数据集中，从F2中收集的蛋白质的比例变化更大。这些差异，不影响NNP的结果或运动分析的结果。（C）非偏性的鉴别由HIV-1感染导致的移位事件。每种蛋白根据移位的程度进行评分（M值，x轴），同时移位的方向的可复制性（R评分，y轴）跨越了两个重复。MR作图分析显示出上1/4象限的显著移位。M >1和R > 0.9的蛋白对于改变位置是候选蛋白（估计FDR = 8%）。（D）最靠前的26个蛋白的运动（MOV10，SPN，SERINC3）用不同颜色进行高亮表示。每个蛋白的位置采用非感染（圆圈）和HIV-1感染（红色三角形）表示。箭头表明感染的候选蛋白的运动情况。
表1 与HIV-1 Gag p24具有相似蛋白谱学的蛋白质 
表2 对于Jurkat细胞的HIV感染具有强修饰的EV关联性 
为了更好的理解这些蛋白质是否对于100K颗粒内不同的EVs/病毒子亚型具有特异性，我们采用碘二沙醇梯度分析了相同的标记下该颗粒的分离情况。在来自感染的CCM的100K颗粒中，我们发现病毒蛋白p24主要位于梯度离心的最下层组分中。相同的分布在SPN和MOV10中也被发现（图5C）。在不同组分中对于MOV10，SPN和p24中所观察到的相对丰度的相同分布在将CCM从感染细胞中分离后获得，并显示出这些蛋白质更倾向于于在相同的颗粒中存在（图5D）。相反，SERINC3富集的片段与包含p24的片段相似但也存在差异（图5C和E），导致这种EVs中的蛋白与病毒颗粒存在差异。不仅如此，当将对照和感染样本进行比较时，我们观察到含有SERINC3的囊泡显示出向密度更大的组分移动的现象（图5F）。这种SERINC3的变化在感染后不同片段中被检测出来，并与MR分析的结果共同表明宿主EVs中包含了这种蛋白并改变了HIV1的感染状况。SPN是一种跨膜蛋白并因此暴露于EVs的表面区域。我们接着采用包裹抗SPN抗体的磁珠进行免疫分离，以证实SPN蛋白是否整合进入了HIV病毒子中。通过Western blot对免疫分离的粒子（PD）进行分析表明：我们捕获了约30%的包含SPN的EVs。重要的是，抗SPN也捕获了大约30%的MOV10和25%的在HIV感染分析中与来自感染的报告细胞相同的比例较低的SPN⁺的EVs（图5I）。这些结果都证明了携带SPN的EVs也代表了包含MOV10的HIV颗粒，但不包含或者包含很少的SERINC3，该结果与MR分析所预测的结果一致。
5. SERINC3的下调调控了EVs的表面组成和数量
SERINC3被描述为一种病毒的限制因子，可抵消Nef的作用，Nef阻止了其进入HIV-1病毒颗粒中。事实上，当我们采用碘二沙醇梯度离心法将EVs从感染Nef缺乏的HIV-1的细胞中分离，则SERINC3与病毒p24处于同一个组分中（图EV3A）。相反，通过感染含有Nef的病毒，SERINC3不存在于病毒颗粒中并且参与了由未感染和感染细胞产生的不同类型的EVs（图5C）。为了分析SERINC3在EVs的生物学合成中的可能作用，我们下调了其在Jurkat细胞中的表达（图EV3B），SERINC3 KD细胞未被感染或者同时被有和没有Nef的HIV-1感染。正如文献中所预测的，通过感染缺乏Nef的病毒，来自SERINC3 KD细胞的上清液比对照组细胞产生的上清液更具有感染性（图EV3C）。但是，在Nef存在的情况下，SERINC3的下调对其感染性潜力没有显著的影响（图6A和EV3C），但是它增加了细胞中表达的三种SERINC3 shRNA其中两种感染后48h后上清液中颗粒的数量（图6B和EV3D）。相比对照组细胞，感染后通过碘二沙醇梯度分离出的sEVs显示p24的量及其在梯度离心后的不同组分的分布未受到SERINC3 KD细胞持续的感染（图6C和D，通过抑制混池的shRNA获得KD细胞）。因此，从SERINC3 KD细胞中释放的颗粒数量的增加是由于不同病毒颗粒的EVs释放增加所导致的。虽然p24的量并未受到SERINC3下调的影响，但是我们在HIV-1感染后检测到了SPN参与到sEVs/病毒量的增加（图6C和D）。从CCM中获得的对2K，10K，100K颗粒的分析结果表明SPN的增加也发生在未被SERINC KD细胞感染所释放的EVs中（图6E和F）。由于SERINC3下调改变了SPN在EVs病毒的表面的表达，我们决定通过多重流式细胞分析法去分析其他EV表面蛋白。在捕获包裹了不同单克隆抗体的磁珠后，EVs通过联合3个APC-标记的抗CD9，CD81和CD63四黄烷蛋白（TSP）被检测到。来自SERINC3 KD细胞的EVs与来自对照细胞的EVs相比表面组成不同。在来自SERINC3 KD细胞的TSP+-EV表面组成与来自HIV-1感染细胞的EVs表面组成相似。与从对照细胞中分离出的EVs相比，来自SERINC3 KD和HIV-1感染细胞的TSP+-EVs代表了CD31，CD69，HLA-ABC，SSEA-4水平的降低，以及，在较少程度上，CD4，CD1c，CD49e（ITGA5；图6G）。因此，SERINC3的下调改变了EVs的表面。图5 MOV10和SPN包括在病毒颗粒中，而SERINC3从病毒中被排除并位于病毒修饰的EVs中
（A, B）（A）在对照和感染（红色方框）Jurkat细胞中从CCM中的EV颗粒中的3个候选标记的分析。一系列的颗粒（2K，10K，100K）通过Western blot进行分析，采用抗SPN，MOV10，SERINC3和p24（HIV-1蛋白）的抗体。从20 ×10⁶个细胞中分离出的2K，10K和100K颗粒上样。代表性图（A）以及在3-5个独立试验中的定量分析（B）。对于每一个颗粒，AU代表被分析在给定颗粒中分析蛋白的密度与相同颗粒蛋白含量的比率。在来自相同试验中的细胞裂解液AU（给定蛋白/蛋白质总量）对于SPN和MOV10分别为1.29 ± 0.15和0.84 ± 0.33倍的对照组细胞水平。（C） WB显示在6个组分中相同蛋白的分布，这6个组分是在速度离心分离后收集的，包含在对照或HIV-1感染的100K颗粒（红色方框）中。病毒p24蛋白感染样本的从底部组分收集，MOV10和SPN，SERINC3从中间组分中收集。（T = 顶部；B = 底部）。（D, E）来自HIV-1感染样本的4到7个独立的WB条带中MOV10，SPN，SERINC3和p24信号的定量分析。AU = 给定颗粒的条带密度/总量（所有6个样本的条带密度）（F）在来自对照和感染样本不同组分中SERINC3 信号的定量。AU = 给定颗粒的条带密度/总量（在所有12个颗粒中的条带密度）。线代表3个独立实验的中位数。（G,H）来自HIV感染的Jurkat细胞的EVs采用与抗SPN偶联的磁珠进行免疫分离。磁珠相关的囊泡采用SPN，MOV10，CD63，SERINC3和病毒p24特异的抗体进行WB分析，代表性图（G）和定量（H）在PD中信号比例的平均值 ± 标准差与总的3个独立试验进行比较。（I）留在EVs中相同数量细胞分泌的FT或EVs但是不经过免疫分离被用于感染一个报告细胞系。6个独立试验的平均值 ± 标准差。 图6 SERINC3的下调改变了Jurkat细胞释放的EVsJurkat细胞采用表达荧光素酶shRNA的慢病毒感染，靶标基因SERINC3，感染或未感染NL4-3 EGFP-Nef⁺ HIV（红色方框）。（A）在来自感染SERINC3 KD细胞上清液处理的GFP⁺ Ghost X4R5细胞。结果采用感染的对照细胞上清液处理的与GFP⁺细胞比率进行表达。（B）分泌的颗粒数量采用NTA进行定量。结果的表达采用未感染的荧光素酶shRNA细胞的颗粒数量比率进行表达。*P < 0.05，** P < 0.01。显示了3个独立试验的平均值 ± 标准差。（C）来自感染细胞的100K颗粒采用碘二沙醇梯度速度梯度离心进行分离。通过Western Blot分析了6个组分，用于SPN，SERINC3和p24的呈现。（T = 顶部；B = 底部）。（D） SPN和p24在两个独立的碘二沙醇梯度分离的不同组分信号的定量分析（试验1：开放符号，试验2：封闭信号）。AU = 给定颗粒/总量的条带密度（所有12个颗粒的条带密度）。（E, F）来自感染NL4-3 EGFP-Nef⁺的未感染的对照组细胞和SERINC3 KD细胞的2K，10K和100K颗粒通过抗SPN和p24的抗体采用WB进行分析。其中，2K，10K和100K颗粒从20 × 10⁶个细胞中获得并上样。代表性图像（E）以及SPN和p24信号（F）定量图。对于每个颗粒，AU代表在给定颗粒的信号密度与蛋白质总量相对于对照组2K + 10K +100K总量的比率。（G）基于多重流式细胞分析法检测EV表面标记。抗体包被的捕获磁珠采用EV样本进行捕获。捕获的EVs采用APC标记的抗CD9，抗CD63和抗CD81的混合物进行检测。在对背景和抗体校正后所有磁珠群体的APC荧光值定量的中位数。结果转化为相对对照组的值。点状线代表从对照组细胞的CM中分离并获得的值。3个独立试验的平均值 ± 标准差。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。

讨论

这里我们通过一个新的思路鉴别EV亚型的组分，这可能对普适性的试验系统是有用的。后续我们通过一个非偏性的定量蛋白质谱分析，以及NNP交互工具去鉴定潜由相同EVs释放的潜在伴侣分子，或者在生物物理颗粒性质上相似的分子。我们采用运动可复制性（MR）分析方法，可分析释放的EVs的蛋白质组成的改变。这些分析可被扩展到比较在两个或多个不同的病理/生理学状况下释放的EVs感染HIV-1的Jurkat T细胞的情况，NNP和MR工具使得我们可以鉴别几种候选的在病毒颗粒中特异性分泌的宿主蛋白。我们预测了两种潜在病毒蛋白（MOV10和SPN）在sEVs中发现的特有蛋白质（SERINC3），我们的结果也通过证实SERINC3能够控制EVs的表面组成，对进一步进行生物遗传和功能性研究打开了新的途径。EVs根据其生物遗传学来源被分成3个主要的类别：（i）直接从浆膜表面分泌出的EVs（外泌体，微囊泡或微颗粒）；（ii）在细胞内MVEs（外泌体）形成的EVs；（iii）从细胞中产生的经历了凋亡的EVs（凋亡小体）。但是，EVs的杂合度，即使在这些主要的亚型中，在最近几年的研究中也变得明显了。至今为止，大多数的蛋白组学研究提供的在大量EVs制剂中发现的蛋白质包含了各种亚型的混合。该方法发现了一种潜在的与EV亚型相关的组分，对于提高不同EVs功能是必要的。我们的研究提供了一种对于理解EVs分子杂合度的主要工具。之前的研究采用不同EV亚型的蛋白组学评估了用于定义外泌体和其它EV亚型蛋白质标记的特异性。但是，为寻找与每个研究中每种EVs相关的亚型。EV蛋白可仅仅通过手动进行分析，我们开发了一种交互工具，可以覆盖所有从Jurkat细胞分泌的EVs，这些细胞可被灵活的查询以定义其与EV蛋白质的相关性。例如，在最近的蛋白组分析中，我们查询了一个由T细胞分泌的外泌体NNP。虽然其它研究表明在免疫突触外泌体中CD81和CD6分泌的增加，这两个蛋白质在我们的NNP中彼此相隔很远，表明它们可能在两个或多个不同的EVs中释放。我们的方法是无偏的并且有效的分离了包含不同亚细胞来源组分的EVs（例如：浆膜和内体来源的标记具有内质网或线粒体来源的不同蛋白谱）。其次，对于与多种类型EVs相关的蛋白质而言，通过与每种EV类型相关的蛋白质的加权，可获得一个混合的蛋白谱。这种混合的蛋白质谱可能不能直接的被解释，因为潜在的“纯的”EV谱及其加权值未知。然而，这些蛋白质谱仍然携带着一些信息，特别是当与其它蛋白谱进行比较时：如果两种蛋白质具有跨越多种类型EVs的相同分布，它们也会具有相似的蛋白谱。因此，该NNP近邻的输出被看成一组跨越一种或多种EV类型的具有相似分布的蛋白质组，这也表明了这些蛋白质功能上的相关性。如果两种蛋白质具有不同的谱学特征，它们不可能在不同的EVs间具有相同的分布。需要注意的是这并不意味着这些蛋白永远不会存在于相同类型的EV中；而是表明不同的蛋白在EVs之间具有不同的稳定状态。这是由我们在CD81和CD63上的发现所表明的。NNP将这些蛋白置于不同的蛋白簇中，表明这些蛋白质至少存在于两种类型的EVs中；事实上，我们通过生化方法验证表明CD81⁺/CD63^-以及CD81⁺/CD63⁺EVs的存在。最终，该NNP并不能在各种EV亚型中提供截断点或分界线，但是却暗示了具有相关EV蛋白质谱的蛋白。该研究的另一个重要特征是比较谱学分析，该分析鉴别出了EV运载蛋白在细胞扰动过程中的调节过程。我们的方法具有一些局限性；首先，缺乏明显的变化并不意味着无变化；例如，该蛋白可以移动到另一种具有相似颗粒特征的EV中；更加重要的是，MR分析仅检测出不同生物学重复之间稳定的变化。正如任何一种实验设置，生物学和技术上的噪音将掩盖真正的变化，我们严格的预过滤了谱学数据以排除那些可再现性较差的位移，例如，我们将CD63包含在具有可比性的+/-HIV分析中，由于在具有可比性的数据集中进行定量分析CD63多肽的数量较少，这种情况下这些数据是不完整的。所以当我们在图1中的梯度离心分析表明CD63随着HIV的感染而位移，我们不能够通过谱学解释这个观点。然而，MR分析鉴别出大量的蛋白质，其分泌行为受到HIV感染的较强影响，其中我们选择了3种蛋白进行证实。其它MR位移的蛋白质中，或者存在更加微小的重要组分。对于这些候选蛋白，精细的交互工具（表EV2）可能被用于手动评估这些结果的可重现性。我们分析的一个重要结果涉及到HIV-1蛋白Nef。文献报道了EVs中的Nef蛋白相对病毒颗粒的研究中具有矛盾的观察结果。Nef在大量微囊泡簇中被观察到或者在CD45⁺EVs中被排他性的收集，或者在速度梯度离心中包含病毒和非病毒的组分中被收集到。当为HIV1-Nef蛋白查询NNP时，我们发现最邻近的蛋白主要是宿主蛋白，包括几种位于ESCRT通路和CD63通路上的蛋白，但是并无其它的HIV-1编码蛋白。因此，该观察结果表明大多数位于CCM上的Nef包含在可能的内体来源的囊泡亚型中，而非病毒本身。该结果打开了新的分离包含Nef无病毒的EVs的途径（例如通过采用Nef的近邻蛋白作为诱饵），并可精确的评估其在HIV调控的病理学中的作用。考虑到宿主蛋白，我们对非病毒性EVs标记比如CD45和AChE的重新评估低估了其作用（见图1）。通过对Jurkat细胞释放的EVs的蛋白组学分析，我们并未检测出任何被SILAC标记的AChE的多肽，这也证实了我们之前的发现，即大多数EV制剂中的AChE来自于培养细胞的血清。对于CD45，我们发现该蛋白从包含病毒的组分中被排除（图1D），在2K和10K颗粒中比在100K颗粒中更加丰富，在这些颗粒中大量的sEVs和病毒可被发现。另一方面，我们鉴别出两种宿主蛋白，MOV10和SPN，这两种蛋白特异的包含在病毒颗粒中。MOV10是一种RNA解旋酶，已经在HIV-1病毒制剂中被检测到，支持了我们的发现。SPN是一种高丰度的T淋巴细胞表面蛋白，可调控包括激活、增殖和迁移在内的T细胞功能。在极化的T细胞中，SPN特异性的与PM微区域相关联，其中Gag在此区域内被招募。与此一致，我们发现SPN特异的参与到病毒颗粒中。我们在这里进一步描述了SERINC3特异的包含在宿主的sEVs中，在用含Nef的HIV感染后，具有变化的颗粒特性（图5C）。当SERINC3与SERINC5参与进入病毒颗粒后，被描述为限制因子。这种整合行为与Nef发生反作用，从而降低了SERINC3和SERINC5的表面水平并将SERINC5从细胞表面重新定位于核周囊泡中。我们对于SERINC3的观测结果表明另一种针对病毒的方式可消除该限制因子：通过在EVs中进行释放，而非通过降解通路。Nef也通过改变其在后期分泌通路中的转运过程下调CD4。我们描述了Jurkat T细胞感染包含Nef的HIV-1改变了释放的EVs的组成。与对T细胞PM进行蛋白组分析的结果相似，我们发现CD4和HLA水平在四黄烷蛋白 + EVs中的下降能够至少部分的反应PM的变化。更重要的是，我们发现SERINC3的下调导致EVs与HIV感染的相似的变化。敲低SERINC3增加了EVs的释放并改变了其表面的蛋白质组成，使得SPN能够整合。因此，Nef介导的SERINC3路径变化能够解释感染导致的宿主和病毒EVs组成改变过程中蛋白质转运的变化。SERINC3的下调在哪种程度上可解释Nef介导的PM或蛋白质转运的变化仍需被确定。总之，本研究提供了一个有力的工具，揭示了通过特定细胞类型释放的EVs的多样性，并理解了在不同生理和病理学状况下释放EVs的多样性。我们提出采用相同的实验设计在病理/生理学扰动下去检测EV组成的分子变化，例如在暴露于缺氧状态下的EV的组成，模拟了肿瘤的血管化核心。该无偏的鉴定不同EV亚型的运载蛋白，结合对单个EVs的分析，将优化使用EVs进行治疗的手段。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33709510/

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